艱難梭菌(CD)熒光PCR核酸擴增檢測試劑盒說明書

【產品名稱】

通用名稱：艱難梭菌 (CD)核酸擴增檢測試劑盒(PCR 熒光探針法)

Name ：Diagnostic Kit for Clostridium difficile DNA（PCR Fluorescence Probing）

【包裝規格】48T/盒

【預期用途】

本試劑盒適用于檢測水樣糞便等樣本中的艱難梭菌，用于艱難梭菌感染的輔助診斷，其檢測結果僅供參考。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術，設計一對艱難梭菌特異性引物，結合一條特異性探針，用熒光PCR 技術對艱難梭菌的核酸進行體外擴增檢測， 用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融少于 7 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

取水樣便 0.5~1mL

【保存和運輸】

上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區）

1.1 樣本前處理

13000rpm 離心 2min，去盡上清

1.2 DNA 提取

1) 對上述處理好的標本加入等體積核酸提取液（固體標本加入50μL核酸提取液）， 100℃恒溫處理 10min，13,000 rpm 離心 5min，取上清液轉移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；

2) DNA 的提取也可以采用上海晅科生物科技有限公司生產的DNA提取試劑盒（離心柱提取法），請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2. 試劑配制（試劑準備區）

根據待檢測樣本總數，設所需要的PCR 反應管管數為N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

3. 加樣（樣本處理區）

將步驟 1 提取的 DNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR 擴增（核酸擴增區）

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；

4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇 ROX 參比熒光。

5. 結果分析判定

5.1 結果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體

傾斜時，根據分析后圖像調節Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內調節)、stop

值(一般可在 5~20 范圍內調節)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。

5.2 結果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數增長曲線。

可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，且出現典型擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗

結果出現 Ct 值≤35.0 和典型擴增曲線者為陽性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結果無 Ct 值且無明顯的擴增曲線。

6. 檢測方法的局限性

1）樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；

2）樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；

3）陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；

4）病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

5）不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

6）試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；

7）本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

7. 質控標準

陰性質控品：無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且 Ct 值≤32； 以

上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

8. 產品性能指標

陰陽性參考品符合率：5 份陽性參考品符合率為 100％；10 份陰性參考品符合率為

100％。

低檢測限：1.0×10 3copies/mL。

精密度：批內、批間精密度檢測 Ct 值的變異系數（CV）均小于等于 3%。

【注意事項】

1）所有操作嚴格按照說明書進行；

2）試劑盒內各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心；

3）反應液應避光保存；

4）反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5）使用一次性吸頭、一次性手套和各區工作服；

6）樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；

7）實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8）試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全 通則》進行處理。

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